• 专利附录
  • 专利说明
  • 权利要求
  • 类似技术
  • 同族专利
  • 引用文献
  • 法律状态
  • 优先权
    • 专利摘要:
    本發明係將KMUP類化合物所合成之四級銨哌嗪基團複合鹽類及高分子聚合物，運用於改善高脂血以及體重失衡之醫療功能。
    公开号:TW201311249A
    申请号:TW100132154
    申请日:2011-09-06
    公开日:2013-03-16
    发明作者:Ing-Jun Chen
    申请人:Univ Kaohsiung Medical；
    IPC主号:C07D473-00
    专利说明:
    KMUP複合銨鹽類及高分子聚合物之改善高脂血及體重失衡療效
    本發明係將KMUP類之四級銨哌嗪基團複合鹽類及高分子聚合物，運用於改善高脂血及體重失衡之療效。
    以茶鹼為骨架之黃嘌呤類衍生物其第七位氮基上進行修飾之KMUP-1，能活化上皮以及內皮之內皮性一氧化氮合成酶(eNOS)，部分活化平滑肌可溶性鳥苷酸環化酶(soluble guanylyl cyclase,sGC)、磷酸二酯酶(phosphodiesterase,PDE)抑制作用。業經證實KMUP-1可影響環腺苷單磷酸鹽(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)/蛋白激酶(protein kinase A,PKA)及環鳥嘌呤甘單磷酸鹽(Cyclic guanosine monophosphate,cGMP)/蛋白激酶G(PKG)等路徑，並且會引起氣管上皮細胞一氧化氮之生成量增加，進而活化氣管平滑肌細胞內sGC，KMUP-1或直接活化氣管平滑肌細胞內sGC，使cGMP量增加激活PKG。吳炳男等人於2004年British journal of pharmacology報導KMUP-1也可活化腺苷酸環化酶(adenylate cyclase,AC)引起cAMP量增加而活化PKA，PKA和PKG兩者皆會引起平滑肌細胞膜鉀離子通道開啟，最後使氣管平滑肌鬆弛。cAMP及cGMP係細胞內二次訊傳訊者，同時調節多種生理反應，包括細胞生長及分化、細胞凋亡、醣解作用及酯解作用、免疫及發炎反應等。研究報告指出KMUP-1不但可誘發內生性一氧化氮釋放，亦具備類似供應一氧化氮(NO donor)之藥理作用。因而歷年以相關活性提出發明申請096121950號之抗高血壓、095112923號治療攝護腺肥大、094129421號抗肺動脈高血壓，以及美國12/878451四級銨哌嗪基團複合鹽等發明申請案。
    KMUP類化合物之哌嗪基經由化學合成方式，令礦物酸、呈現機酸以及含呈現羧酸基團之史他汀(Statin)衍生物、抗炎類藥物、前列環素，抗氣喘類藥物製備成為四級銨哌嗪基團複合鹽類。
    發明人曾經構思以KMUP類化合物或哌嗪(piperazine)經由化學合成方式製備之四級銨哌嗪基團複合鹽類。進行四級銨哌嗪基團複合鹽類之合成反應，可將KMUP類化合物混合著C1-C4低醇類與水之混合溶液，與足量之礦物酸，呈現機酸反應形成四級銨鹽類。另外則係KMUP類化合物之礦物酸或其呈現有機酸等四級銨鹽類，混合著C1-C4低醇類與水之混合溶液，其KMUP類化合物之用量需考量混合溶液內足以將『RX』基團之反應藥物如Statin之羧酸衍生物、Statin之酯衍生物、帶保護基團statin之衍生物，抗炎類藥物、前列環素，以及抗氣喘類藥物Montelukast、Cromolyn sodium、Nedocromil等含羧酸基團反應物溶解，隨著水份之性質、反應溫度，而選擇C1-C4低醇類並調整混合溶液之用量，首選係乙醇、異丙醇而搭配5%-30%水分，10%水分搭配90%乙醇或異丙醇。於鹼性催化劑水解Statin之酯衍生物之反應，於混合溶液添加Statin之酯衍生物之用量，約每升10毫摩爾至1摩爾。經迴流混合溶液供反應物達到加速作用，應昇高混合溶液之溫度至40℃-70℃左右，而形成KMUP-1四級銨哌嗪基團之複合鹽類，過濾後需再度溶解於混合溶液，最好在室溫下進行再結晶。上述之礦物酸係包括鹽酸、氫溴酸、氫碘酸、硫酸、硝酸、磷酸(H3PO4)、磷酸二氫鈉(NaH2PO4)、磷酸氫二鈉(Na2HPO4)等。呈現機酸則選用包括檸檬酸、甘草酸、反丁烯二酸、順丁烯二酸、菸鹼酸、異菸鹼酸、酒石酸、丁二酸、己二酸、脂肪酸、甲磺酸、苯氧戊酸等。均揭示於2010年1月29日，案號為099102735號之本國專利申請案。
    statins類藥物有益於心血管系統，不僅在於降低膽固醇之作用，尚且涵蓋著顯著之異戊二烯(isoprenoid)合成之抑制作用，該產品係提供細胞內信號之重要脂質附件(lipid attachments)等多效性作用。
    發明人鑑於習知技術尚呈現所不完備處，經過悉心試驗與研究，並一本鍥而不捨之精神，終構思出本案「KMUP複合銨鹽類高分子聚合物之改善高脂血及體重失衡療效」，能夠克服先前技術之不足，以下為本案之簡要說明。
    發明人更構思該KMUP類化合物可經由化學合成方式與Statin類藥物、羧甲基纖維素鈉、高分子聚合物或聚麩胺酸基團衍生物等含有羧酸基團結構之藥物，製備成為式(I)之四級銨哌嗪基團複合鹽類(piperanium ion complex)。
    根據其構想，一種複合鹽類化合物，具有如式(I)所示之結構，其中R2與R4可分別選自以下所組成之群組：氫基、鹵素、胺基、硝基之取代基；碳數1-5烷基之取代基；碳數1-5烷氧基之取代基；RX其係選自以下所組成含羧酸基團群組之一：Statin類藥物、羧甲基纖維素鈉(sodium CMC)、高分子聚合物或聚麩胺酸基團衍生物藥物；以及RX-可為上述基團帶負電之陰離子。
    若非特別敘明於發明說明書內以KMUP類或KMUPS代表KMUP-1、KMUP-2、KMUP-3及KMUP-4，而KMUP類化合物，係KMUP類與含羧酸基團衍生物之Statin類藥物、羧甲基纖維素鈉(sodium carboxyl methylcellulose,sodium CMC)、高分子聚合物及聚麩胺酸基團衍生物藥物等經合成四級銨哌嗪基團之複合鹽類。
    如式(I)之KMUP類化合物或其四級銨哌嗪基團複合鹽類，其中KMUP類可代表為KMUP-1、KMUP-2、KMUP-3與KMUP-4等，如(7-2-4-(2-氯苯)哌嗪基]乙基]-1,3-二甲基黃嘌呤(7-[2-[4-(2-chloro-phenyl)piperazinyl]-ethyl]-1,3-dimethylxanthine,KMUP-1)，KMUP-2係7-2-4-(2-甲氧基苯)哌嗪基]乙基]-1,3-二甲基黃嘌呤(7-[2-[4-(2-methoxybenzene)-piperazinyl]ethyl]-1,3-dimethylxanthine)，KMUP-3係7-2-4-(4-硝基苯)哌嗪基]乙基]-1,3-二甲基黃嘌呤(7-[2-[4-(4-nitrobenzene)piperazinyl]ethyl]-1,3-dimethyl-xanthine)，而KMUP-4係7-2-4-(2-硝基苯)哌嗪基]乙基]-1,3-二甲基黃嘌呤(7-[2-[4-(2-nitrobenzene)piperazinyl]-ethyl]-1,3-dimethylxanthine)。
    上述式(I)之RX基團均可選自Statin類藥物、羧甲基纖維素鈉(sodium carboxyl methylcellulose,sodium CMC)、高分子聚合物(Co-polymers)藥物及聚麩胺酸(γ-PGA)基團衍生物等含羧酸基團之藥物，-RX可為上述基團帶負電之陰離子，上述鹵素係指氟、氯、溴、碘等基團。含羧酸基團之Statin類藥物，必要時係指結構上含羧酸基團之市售史他汀(Statin)類藥物，包括阿托伐他汀(Atorvastatin)、西立伐他汀(Cerivastatin)、氟伐他汀(Fluvastatin)、羅瓦斯達汀(Lovastatin)、美伐他汀(Mevastatin)、普伐他汀(Pravastatin)、瑞舒伐它汀(Rosuvastatin)、以及辛伐他汀(Simvastatin)。高分子聚合物(Co-polymers)，必要時係指結構上含羧酸基團之高分子量聚合分子，包括玻尿酸(hyaluronic acid)、聚丙烯酸(polyacrylic acid)、聚甲基丙烯酸脂(polymethacrylates)、優特奇(Eudragit)、硫酸葡聚醣(dextran sulfate)、硫酸乙醯肝素(heparan sulfate)、聚乳酸(polylactic acid或稱為polylactide,PLA)、聚羥基乙酸(polyglycolic acid,PGA)、聚乳酸鈉(polylactic acid sodium,PLA sodium)、聚羥基乙酸鈉(polyglycolic acid sodium,PGA sodium)。玻尿酸亦稱醣醛酸，係指含D-葡萄糖醛酸(D-glucuronic acid)及N-乙醯葡糖胺(N-Acetyl-D-Glucosamine,NAG)單元組成之高分子聚合物。聚甲基丙烯酸脂(polymethacrylates,PMMA)係甲基丙烯酸之高分子聚合物，而優特奇(Eudragit)係一種聚甲基丙烯酸脂之產物。硫酸葡聚醣與硫酸乙醯肝素，係由硫酸基團聚合之多醣分子。
    含羧酸基團之聚麩胺酸(poly-γ-polyglutamic acid,γ-PGA)基團衍生物，必要時係指結構上含羧酸基團之海藻酸鈉(alginate sodium)、聚麩胺酸(poly-γ-polyglutamic acid,γ-PGA)、聚麩胺酸鈉(poly-γ-polyglutamic acid sodium,γ-PGA sodium)或是聚賴胺酸與海藻酸鈉交聯之聚海藻酸鈉(alginate-poly-lysine-alginate,APA)、聚乳酸鈉(polylactic acid sodium;PLA sodium)、聚羥基乙酸鈉(polyglycolic acid sodium;PGA sodium)。
    根據其構想，KMUP類化合物選擇與Statin類藥物、羧甲基纖維素鈉(sodium CMC)、高分子聚合藥物及聚麩胺酸基團衍生物藥物等含羧酸基團之一藥物加以混和，抑或經由合成如式(I)之四級銨哌嗪基團複合鹽類，均可呈現改善高脂血及體重失衡等醫療功能。
    根據上述構想，KMUP類化合物選擇與Statin類藥物、羧甲基纖維素鈉(sodium CMC)、高分子聚合物及聚麩胺酸基團衍生物等含羧酸基團之一藥物混和，抑或經由合成如式(I)之四級銨哌嗪基團複合鹽類，於添加適量賦形劑均可成為一種藥物組合物，運用製劑方式處理成適宜投與哺乳類動物體內各種劑型，而呈現上述改善高脂血及體重失衡之醫療功能。
    根據上述構想，KMUP類化合物所合成如式(I)之四級銨哌嗪基團複合鹽類，其間添加反應之RX基團為一單位摩爾量合成如上述式(I)四級銨哌嗪基團複鹽類，係KMUP類與單量體羧酸基團合成之四級銨哌嗪基團複鹽類。而基於反應酸之用量以及立體結合之因素，投與參與反應之RX量充足之狀態下，可為二單位摩爾量以上，則可呈現如式(II)所示之雙量體羧酸基團之四級銨哌嗪基團複鹽類。
    不論單量體或雙量體之四級銨哌嗪基團複合鹽類於添加適量賦形劑均可成為一種藥物組合物，運用製劑方式處理成適宜投與哺乳類動物體內各種劑型，而呈現上述改善高脂血及體重失衡之醫療功能。
    將2-氯乙基茶鹼(2-chloroethyl theophylline)、2-氯苯基哌嗪(2-chlorophenyl piperazine)依分子量之百分比溶解於含水乙醇(hydrous ethanol)之鹼性溶液加熱並回流3小時。靜置過夜冷卻後倒出上清液，經減壓濃縮除去溶媒，再溶於1倍體積之乙醇及其3倍體積之2N鹽酸，置於50至60℃水浴形成pH 1.2之飽和溶液。經活性炭脫色、過濾、靜置過夜、過濾，獲得KMUP-1 HCl之白色結晶。
    將2-氯乙基茶鹼及4-硝基苯基哌嗪依分子量之百分比溶解於含水乙醇溶液中加熱並回流3小時。隔夜冷卻後倒出上清液，經減壓濃縮乾固，再加入1倍體積之乙醇及其3倍體積之2N鹽酸於50至60℃下水浴溶解成pH 1.2之飽和溶液。以活性炭脫色、過濾、放置隔夜、過濾，即可獲得KMUP-3 HCl之黃色結晶。
    將2-氯乙基茶鹼(2-chloroethyl theophylline)、2-甲氧基苯基哌嗪(2-methoxybenzene piperazine)依分子量之百分比溶解於含水乙醇(hydrous ethanol)之鹼性溶液溶液中加熱並回流3小時。靜置過夜冷卻後倒出上清液，經減壓濃縮除去溶媒，再溶於1倍體積之乙醇及其3倍體積之2N鹽酸(HCl)，置於50至60℃水浴形成pH 1.2之飽和溶液。經活性炭脫色、過濾、靜置過夜、過濾，獲得KMUP-2 HCl之白色結晶。
    羧甲基纖維素鈉(sodium carboxyl methyl cellulose;sodium CMC)或高分子聚合物、聚麩胺酸基團之鹽類溶於鹼性溶液，添加KMUP類或其鹽酸鹽置於50至70℃水浴反應後，室溫下添加乙醇放置過夜進行結晶，過濾獲得KMUP類-羧甲基纖維素複合鹽類、KMUP類-高分子聚合物或KMUP類-聚麩胺酸基團複合物。上述鹼性溶液係選自添加氫氧化鈉(NaOH)或碳酸氫鈉(NaHCO3)所形成之溶液。
    根據上述構想本發明KMUP類化合物所合成式(I)或式(II)之四級銨哌嗪基團複合鹽類，係選擇Statin類藥物、羧甲基纖維素鈉、高分子聚合物或聚麩胺酸基團衍生物等含有羧酸基團結構之藥物，適宜運用於改善高脂血及體重失衡之醫療功能。具體而言係指KMUP-1-阿托伐他汀複合鹽類、KMUP-2-阿托伐他汀複合鹽類、KMUP-3-阿托伐他汀複合鹽類、KMUP-4-阿托伐他汀複合鹽類；KMUP-1-西立伐他汀複合鹽類、KMUP-2-西立伐他汀複合鹽類、KMUP-3-西立伐他汀複合鹽類、KMUP-4-西立伐他汀複合鹽類；KMUP-1-氟伐他汀複合鹽類、KMUP-2-氟伐他汀複合鹽類、KMUP-3-氟伐他汀複合鹽類、KMUP-4-氟伐他汀複合鹽類；KMUP-1-羅瓦斯達汀複合鹽類、KMUP-2-羅瓦斯達汀複合鹽類、KMUP-3-羅瓦斯達汀複合鹽類、KMUP-4-羅瓦斯達汀複合鹽類；KMUP-1-美伐他汀複合鹽類、KMUP-2-美伐他汀複合鹽類、KMUP-3-美伐他汀複合鹽類、KMUP-4-美伐他汀複合鹽類；KMUP-1-普伐他汀複合鹽類、KMUP-2-普伐他汀複合鹽類、KMUP-3-普伐他汀複合鹽類、KMUP-4-普伐他汀複合鹽類；KMUP-1-瑞舒伐它汀複合鹽類、KMUP-2-瑞舒伐它汀複合鹽類、KMUP-3-瑞舒伐它汀複合鹽類、KMUP-4-瑞舒伐它汀複合鹽類；KMUP-1-辛伐他汀複合鹽類、KMUP-2-辛伐他汀複合鹽類、KMUP-3-辛伐他汀複合鹽類、KMUP-4-辛伐他汀複合鹽類；KMUP-1-羧甲基纖維素複合鹽類、KMUP-2-羧甲基纖維素複合鹽類、KMUP-3-羧甲基纖維素複合鹽類、KMUP-4-羧甲基纖維素複合鹽類；KMUP-1-玻尿酸複合鹽類、KMUP-2-玻尿酸複合鹽類、KMUP-3-玻尿酸複合鹽類、KMUP-4-玻尿酸複合鹽類；KMUP-1-聚丙烯酸複合鹽類、KMUP-2-聚丙烯酸複合鹽類、KMUP-3-聚丙烯酸複合鹽類、KMUP-4-聚丙烯酸複合鹽類；KMUP-1-聚甲基丙烯酸脂複合鹽類、KMUP-2-聚甲基丙烯酸脂複合鹽類、KMUP-3-聚甲基丙烯酸脂複合鹽類、KMUP-4-聚甲基丙烯酸脂複合鹽類；KMUP-1-優特奇複合鹽類、KMUP-2-優特奇複合鹽類、KMUP-3-優特奇複合鹽類、KMUP-4-優特奇複合鹽類；KMUP-1-聚乳酸複合鹽類、KMUP-2-聚乳酸複合鹽類、KMUP-3-聚乳酸複合鹽類、KMUP-4-聚乳酸複合鹽類；KMUP-1-聚羥基乙酸複合鹽類、KMUP-2-聚羥基乙酸複合鹽類、KMUP-3-聚羥基乙酸複合鹽類、KMUP-4-聚羥基乙酸複合鹽類；KMUP-1-硫酸葡聚醣複合鹽類、KMUP-2-硫酸葡聚醣複合鹽類、KMUP-3-硫酸葡聚醣複合鹽類、KMUP-4-硫酸葡聚醣複合鹽類；KMUP-1-硫酸乙醯肝素複合鹽類、KMUP-2-硫酸乙醯肝素複合鹽類、KMUP-3-硫酸乙醯肝素複合鹽類、KMUP-4-硫酸乙醯肝素複合鹽類；KMUP-1-海藻酸複合鹽類、KMUP-2-海藻酸複合鹽類、KMUP-3-海藻酸複合鹽類、KMUP-4-海藻酸複合鹽類；KMUP-1-聚麩胺酸複合鹽類、KMUP-2-聚麩胺酸複合鹽類、KMUP-3-聚麩胺酸複合鹽類、KMUP-4-聚麩胺酸複合鹽類；KMUP-1-聚海藻酸複合鹽類、KMUP-2-聚海藻酸複合鹽類、KMUP-3-聚海藻酸複合鹽類、KMUP-4-聚海藻酸複合鹽類等等。
    烷基係單價之飽和烴基(hydrocarbon radical)，以單鏈連接碳原子，該碳氫化合物可形成直鏈(straight-chain)、支鏈(branched)或環狀(cyclic)。"碳數C1-C5烷基"係指含1到5個碳原子之烷基基團，較佳之碳數C1-C5烷基為甲烷基(methyl)、乙烷基(ethyl)、正丙烷基(n-propyl)、異丙烷基(isopropyl)、正丁烷基(n-butyl)、異丁烷基(iso-butyl)、仲丁烷基(sec-butyl)、叔丁烷基(tert-butyl)、正戊烷基(n-pentyl)、異戊烷基(iso-pentyl)、叔戊烷基(tert-pentyl)、新戊烷基(neo-pentyl)。
    烷氧基(alkoxy)係一種烴基團，以單個氧原子取代烷基之一碳原子。碳數C1-C5烷氧基，較佳為甲烷氧基(methoxyl)、乙烷氧基(ethoxyl)、正丙烷氧基(n-propoxyl)、異丙烷氧基(isopropoxyl)。正丁烷氧基(n-butoxyl)、異丁烷氧基(iso-butoxyl)、仲丁烷氧基(sec-butoxyl)、叔丁烷氧基(tert-butoxyl)、正戊烷氧基(n-pentoxyl)、異戊烷氧基(iso-pentoxyl)、叔戊烷氧基(tert-pentoxyl)。
    經由肝細胞從甲羥戊酸(mevalonate)生合成異戊二烯化合物之異戊二烯焦磷酸(farnesyl pyrophosphate,FPP)和四異戊二烯焦磷酸(geranylgeranyl pyrophosphate,GGPP)，而後形成膽固醇之過程，statins類藥物可競爭性抑制3-羥基-3-甲基戊二醯輔酶A還原酶(3-hydroxy-3-methylglutaryl-CoA reductase,HMG CoA reductase,HMGR)而減少甲羥戊酸之生成進而影響膽固醇之產量。
    3-羥基-3-甲基戊二醯輔酶A，係以其HMGR還原酶(HMG-CoA-R)之催化部位(catalytic site)與statins類藥物呈現特定之競爭性。該3-羥基-3-甲基戊二醯輔酶A代謝成甲羥戊酸(mevalonate)路徑受競爭性抑制，則影響膽固醇合成之前驅分子(precursor molecule)以及諸如異戊二烯(isoprenoid)、異戊二烯焦磷酸(farnesyl pyrophosphate,FPP)和四異戊二烯焦磷酸(geranylgeranyl pyrophosphate,GGPP)等分子。
    GGPP之衍生物能增加RhoA/ROCK以及後續之過氧化物酶體增殖物啟動受體-γ(Peroxisome Proliferative Activated Receptor-γ,PPAR-γ)，均參與著高密度脂蛋白(HDL)之增加。基於從HMG-CoA reductase之抑制以阻斷mevalonate之生成，抑制RhoA之四異戊二烯作用(Geranylgeranylation)，或係增加cGMP路徑等均可令RhoA去活化。當然分別運用GGPP、FPP與甲羥戊酸(mevalonate)，可以阻止細胞內HMGR功能之進行；耗盡GGPP後增加GTP RhoA之含量，又能增強Rho效應之信號。因此，黃嘌呤架構之KMUP-1，其化學結構與statins類藥物不同，可重新審視statins類藥物之作用。
    Rho關聯蛋白激酶(ROCK)已成為statins類藥物和KMUP-1，依賴NO/cGMP路徑抑制RhoA/ROCK所呈現多效性作用之主要機制之新重心。eNOS係內皮性衍生一氧化氮(NO)之主要來源，其間涉及RhoA/ROCK，似乎可做為降低血脂和動脈粥樣硬化之治療目標。最近之證據顯示statins類藥物誘導eNOS表達於血管內皮細胞以改善血管之內皮功能，以及抑制HMGR而導致eNOSmRNA基因之增加。減少Rho GTPase蛋白反應可增加內皮性衍生NO之生成和生物利用度，經由Rho GTPases蛋白調節eNOS係保護心血管作用之重要機制。我們推論eNOS/cGMP之增加且減少RhoA/ROCK有益於包括KMUP-1之類HMGR拮抗劑之多效性作用。
    高脂血症(Hyperlipidemia)係指血液中膽固醇、三酸甘油脂等脂肪物質呈現不正常之偏高含量。重量平衡係以基礎代謝率(basic metabolic rate,BMR)為基準，不論小孩或成人之個體均不宜因為超過每日代謝熱量之所需(anabolism)而增加正常之體重，或由於毒族每日熱量代謝之所需(catabolism)而減輕正常之體重。而通常體重失衡(weight balance)之改善，偏重於改善因為超過每日代謝熱量之所需(anabolism)而呈現體重偏高之現象。
    抗高脂血劑(Anti-hyperlipidemia agent)需要增加高密度脂蛋白(HDL)，因為低高密度脂蛋白膽固醇含量構成心血管疾病之另一危險因素；增加高密度脂蛋白可經由逆轉膽固醇輸送路徑，預防動脈粥樣硬化(atherosclerosis)現象(Brewer HB；2004年)。未知KMUP-1能否從外周邊細胞調解肝內過度之膽固醇含量排泄入膽，以增加高密度脂蛋白或其載脂蛋白(apo-lipoprotein)。腺苷三磷酸結合盒轉運子A1(ATP-binding cassette transpotter A1,ABCA1)在膽固醇之逆運轉(Reverse cholesterol transport,RCT)路徑中扮演重要角色，ABCA1和載脂蛋白A-1(Apolipoprotein A-1ApoA-1)均與膽固醇從細胞流出調節之有關。研究指出膽固醇之排出作用，可藉由抑制RhoA訊息傳遞路徑使過氧化物酶體增殖物啟動受體-γ(PPAR-γ)、肝細胞X受体α基因(liver X receptor-α,LXR-α)、ABCA1升高，該等蛋白質亦與活化RCT路徑成現著重要之關聯。
    所有之哺乳類動物均含有過氧化物酶體增殖物啟動受體(PPARs)，而各個次類則隨特定之組織擁有不同功能。其中，PPAR-γ於脂肪組織、心臟、肝臟、腎臟等器官，控制著脂肪之代謝、分化和儲存，以及發炎反應。已知KMUP-1於缺血再灌注肝臟可恢復PPAR-γ，擁有抗發炎作用。因此，探討KMUP-1能否調節PPAR-γ。
    細胞膽固醇之代謝路徑，其中經由PPARs和LXRα部分已經完全被了解。statins類藥物對激活LXRα和增強ABCA1之反應屬於PPARs之活性證據，可增加LXRα之表達。statins類藥物誘發RhoA/ROCK之抑制作用，與LXRα之活性和增加PPARs之活性有關。已知異戊二烯(isoprenoid)中間體影響PPARs和LXRα之活性，異戊二烯之活性可生成FPP和GGPP，直接經由LXRα之拮抗作用以及間接啟動RhoA之geranylgeranylation，已經證實可抑制ABCA1。KMUP-1是否影響PPAR-γ及相關信號轉導仍須進行研究。
    將KMUP類化合物本身或哌嗪所合成本發明式(I)或式(II)之四級銨哌嗪基團複合鹽類進行實驗，呈現如下所示之活性。
    一、KMUP-1與Simvastatin影響老鼠之體重和飼料攝取量
    如表一所示每3天記錄飼養8週老鼠之體重與飼料攝取量，餵食高脂肪飼料老鼠體重上升之幅度，比較標準飼料(STD)對照組大約增加2.3倍。投與KMUP-1(2.5-5 mg/kg)或simvastatin(5 mg/kg)，均可有效地降低體重之增加。在飼料攝取方面，餵食高脂肪飼料之老鼠，不論同時投與KMUP-1或simvastatin，均比餵食標準飼料對照組呈現減少攝取量之現象。而投與KMUP-1之劑量1-5 mg/kg或simvastatin(5 mg/kg)之組別跟餵食高脂肪飼料(HFD)組比較並無差異性，顯示KMUP-1或simvastatin均不足以造成老鼠食慾減低，降低飼料攝取量現象。可推論KMUP-1與simvastatin所呈現改善高脂血異常作用和預防體重上升之效果，並非老鼠攝取飼料量減少所造成之現象。
    (註)1.每組實驗老鼠6隻
    2.KMUP-1-b之KMUP-1用量2.5 mg/kg，KMUP-1-c之KMUP-1用量5 mg/kg，simvastatin用量5 mg/kg
    3.#P<0.05與標準飼料比較；*P<0.05與高脂肪飼料比較
    二、KMUP-1及simvastatin於高脂肪飼料所誘導之血脂異常之小鼠血清生化值之影響
    A.　血清總膽固醇(total cholesterol,TC)、三酸甘油酯(Triglyceride,TG)、高密度脂蛋白(high density lipoprotein,HDL)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein,LDL)為評估血脂異常與否之生化指標。
    如表二所示飼養8週後，小鼠心臟血之之血清生化值。高脂肪飼料組之血清總膽固醇(TC)、三酸甘油酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)值都明顯地比對照組高，而高密度脂蛋白(HDL)也比標準飼料對照組略高，顯示老鼠餵食高脂肪飼料確實能誘導出血脂異常。高脂肪飼料組誘導之血脂異常老鼠，同時投與KMUP-1可明顯地改善高脂血異常，同時經口投與KMUP-1(1-5 mg/kg)組與單純之高脂肪飼料組相比較，均可明顯降低血清中血清總膽固醇(TC)、三酸甘油酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)之量。投與KMUP-1組別不論1-5 mg/kg所呈現高密度脂蛋白(HDL)血清值，與單純之高脂肪飼料組比較亦增高。投與Simvastatin與單純之高脂肪飼料組比較，也顯降低TC、TG、LDL血清值和增高高密度脂蛋白之作用。表三結果顯示KMUP-1和Simvastatin均具有改善高脂血異常之作用。
    (註)1.KMUP-1-b之KMUP-1用量2.5 mg/kg，KMUP-1-c之KMUP-1用量5 mg/kg，
    2. KMUP-1-Simvastatinic Acid用量5 mg/kg
    (註)1.高密度脂蛋白膽固醇(High Density Lipoprotein Cholesterol,HDL-C)
    2.低密度脂蛋白膽固醇(Low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)
    *,significantly dofferent from HFD group
    B.血清中天門冬氨酸氨基轉移酶、丙氨酸氨基轉移酶之值
    體內酵素天門冬氨酸氨基轉移酶(aspartate aminotransferase,AST)，主要在肝臟，或心臟、腦部、血球等部位，偏高AST數值之部位代表可能發生病變，尤其肝臟器官顯現較大之可能性。但是單獨天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)之含量數值，對於肝臟缺乏專一性，貯存於肝細胞之丙氨酸氨基轉移酶(ALT)對肝臟較具專一性，必須同時測定兩種以評估肝細胞之受損程度。如表四所示，高脂肪飼料組之含量值與標準飼料對照組並無顯著差異性，投與KMUP-1(5 mg/kg)之含量值也與前兩組並無顯著差異性。由於AST、ALT之測量值，亦可評估藥物對於肝細胞之毒性，表四之含量值顯示KMUP-1(5mg/kg)並無肝毒性。
    (註)1.KMUP-1-C之KMUP-1用量5 mg/kg，
    三、KMUP-1抑制羥甲基戊二醯輔酶A還原酶之活性，但增加在人類肝癌細胞株(HePG2)HMGR之蛋白表現量
    在活性分析實驗中KMUP-1(0.001-10μM)如第一圖所示，可隨著濃度呈現相關性減低羥甲基戊二醯輔酶A還原酶(HMG-CoA reductase,HMGR)之活性，simvastatin(10μM)也可降低HMGR之活性。如第二圖(A)所示於人類肝癌細胞株(HepG2)投與KMUP-1而與第二圖(B)之simvastatin(0.001-10μM)分別實驗24小時，可發現HMGR之蛋白表現量明顯上升。另外由如第三圖所示，老鼠在高脂肪飼料餵食8週後HMG-Co A reductase之表現量明顯降低，而投與KMUP-1(2.5-5mg/kg)或simvastatin(5mg/kg)之組別則呈現明顯回升。
    四、HepG2細胞中添加mevalonate可降低HMGR之蛋白表現量
    在HePG2細胞中添加甲戊二羥酸(mevalonate)24小時測試HMGR能否被負回饋機制作用所抑制，如第四圖(A)所示mevalonate(60-100μM)確實會使HMG-CoA reductase下降。選擇100μM之mevalonate添加細胞30分鐘後，再投與simvastatin(10μM)或KMUP-1(10μM)24小時，如第四圖(B)所示HMG-CoA reductase表現量受上述藥物影響分別回升大約至50%和70%，此結果符合上述之負回饋機制與假設。
    五、KMUP-1增加PPAR-γ、LXR-α、ABCA1、ApoA-I之蛋白表現
    高脂肪飼料餵食之老鼠分別投與1、2.5、5mg/kg劑量KMUP-1或simvastatin(5mg/kg)，如第五圖(A)所示兩種藥物可增加過氧化物酶體增殖物啟動受體-γ(PPAR-γ)之蛋白表現量，第五圖(B)顯示兩種藥物可增加腺苷三磷酸結合盒轉運子A1(ATP-binding cassette transporter A1,ABCA1)之蛋白表現量，而第五圖(C)顯示兩種藥物可抑制Rho關聯蛋白激酶2(Rho kinase II,ROCKII)之表現。於HePG2細胞中投與0.001-10μM劑量KMUP-1與simvastatin經24小時，分別顯示兩種藥物均可隨著濃度呈現相關性增加蛋白之表現；如第六圖(A)與(B)顯示PPAR-γ，第七圖(A)與(B)顯示腺苷三磷酸結合盒轉運子A1(ATP-binding cassette transporter A1,ABCA1)，第八圖(A)與(B)顯示載脂蛋白A-1(apolipoprotein A-1,APOA-1)以及第九圖顯示肝細胞X受体α基因(LXR-α)增加之現象。
    六、KMUP-1與simvastatin影響著RhoA和ROCKII之活性
    於細胞膜與細胞質之分別實驗各投與0.001-10μM劑量KMUP-1經24小時後，如圖十所示，於細胞膜具隨著濃度呈現相關性之抑制RhoA之活性。如第十一圖所示，餵食高脂肪飼料之老鼠投與KMUP-1(1,2.5,5mg/kg)或simvastatin(5mg/kg)亦可呈現抑制ROCKII之表現。於HepG2細胞，如第十二圖(A)所示KMUP-1(0.001-10μM)與第十二圖(B)所示simvastatin(0.001-10μM)均隨著濃度呈現相關性之抑制Rho關聯蛋白激酶2(ROCK II)之表現。
    七、KMUP-1、Simvastatin、C3 exoenzyme與Y27632影響HepG2細胞ROCK II、PPAR-γ、ABCA1之表現
    分別添加RhoA抑制劑之C3胞外酶(exoenzyme)或Rho kinase抑制劑之Y27632於細胞，24小時以確認ROCK II受抑制，觀察ROCK II、PPAR-γ、ABCA1之表現量。如第十三圖(A)所示simvastatin(10-5M)、KMUP-1(10-5M)、C3 exoenzyme(10μg/ml)、Y27632(10-5M)均可抑制ROCK II。如第十三圖(B)、(C)所示四個藥物之影響下PPAR-γ、ABCA1之表現，呈現明顯不同程度之增加現象。
    八、HepG2細胞經異戊二烯刺激引起RhoA之活性和ROCK II之表現受KMUP-1所影響
    Argmamm,C.A.等人於2005年J. Biol. Chem.第280卷第22212頁報導異戊二烯(isoprenoid)可激活RhoA降低ABCA1之表現，而simvastatin則無類似之反轉作用，代表simvastatin增加ABCA1表現之作用，確實係憑藉著抑制HMG-CoA reductase之作用，減少isoprenoids之含量而抑制RhoA。
    上述實驗之結果，KMUP-1之作用幾乎與simvastatin相近似，推論KMUP-1可經由抑制HMG-CoA reductase而增加ABCA1之表現，為評估是否尚可經由抑制四異戊二烯焦磷酸(geranylgeranyl pyrophosphate,GGPP)路徑以抑制RhoA，因此於細胞中單獨添加10μM異戊二烯焦磷酸(farnesyl pyrophosphate,FPP)探討ROCK II之表現。
    如第十四圖(A)所示，單獨以FPP處理24小時確實引起ROCK II表現之增加，以FPP處理30分鐘後再投與KMUP-1(0.001-10 μM)經24小時則降低ROCK II之表現。如第十四圖(B)所示，於細胞單獨添加10μM GGPP，發現GGPP會活化RhoA且增加ROCK II之表現。以GGPP處理30分鐘後再添加KMUP-1(0.001-10μM)24小時，如第十四圖(C)所示，於細胞膜可隨著濃度呈現相關性減少RhoA/ROCK II之作用。但第十五圖顯示0.001-10μM之simvastatin則無類似之作用。
    九、HepG2細胞經異戊二烯(isoprenoids)刺激引起PPAR-γ、ABCA1之表現受KMUP-1所影響
    單獨以FPP(10μM)處理HepG2細胞24小時，如第十六圖(A)、(B)所示造成PPAR-γ、ABCA1蛋白表現降低之現象，30分鐘後加入KMUP-1(0.001-10μM)經24小時可上升PPAR-γ、ABCA1之表現。另外單獨於細胞添加GGPP(10μM)經24小時，如第十七圖(A)、(B)所示亦導致PPAR-γ、ABCA1表現之降低，而添加KMUP-1(0.001-10μM)後，又具有隨著濃度呈現相關性增加PPAR-γ、ABCA1表現之現象。
    十、KMUP-1與cGMP抑制劑影響HepG2細胞之ROCK II表現
    於平滑肌細胞中，已知KMUP-1可經由增加cGMP而抑制ROCK II表現。於HepG2細胞單獨添加10μM之cGMP抑制劑Rp-8-pCPT-cGMPs，24小時後發現Rp-8-pCPT-cGMPs可增加ROCK II之表現。於該細胞，以相同濃度之Rp-8-pCPT-cGMPs與KMUP-1同時添加，與單獨添加Rp-8-pCPT-cGMPs相比較，如第十八圖所示KMUP-1(10μM)之添加可減少ROCK II之表現。
    上述賦形劑或稱為『藥學上可接受之載體或賦形劑』、『生物可利用之載體或賦形劑』，係包括溶媒、分散劑、包衣、抗菌或抗真菌劑，保存或延緩吸收劑等任何習知用於製備成劑型之適當化合物。通常此類載體或賦形劑，本身不具備治療疾病之活性，且將本發明所揭示之衍生物，搭配藥學上可接受之載體或賦形劑，製備之各劑型，投與動物或人類不致於造成不良反應、過敏或其它不適當反應。因而本發明所揭示之衍生物，搭配藥學上可接受之載體或賦形劑，係適用於臨床及人類。運用本發明化合物之劑型經由靜脈、口服、吸入或經由鼻、直腸、陰道等局部或舌下等方式投藥，可達到治療效果。對於不同病症之患者，約每日投與0.1mg至100 mg之活性成份。
    該載體隨各劑型而不同，無菌注射之組成物可將溶液或懸浮於無毒之靜脈注射稀釋液或溶劑中，此類溶劑如1,3-丁二醇。其間可接受之載體可為苷酸露醇(Mannitol)或水。此外固定油或以合成之單或雙苷酸油酯懸浮介質，係一般習用之溶劑。脂肪酸，如油酸(Oleic acid)、橄欖油或蓖麻油等與其苷酸油酯衍生物，尤其經多氧乙基化之型態皆可作為製備注射劑並為天然醫藥可接受之油類。此等油類溶液或懸浮液可含長鏈酒精稀釋液或分散劑、羧甲基纖維素或類似之分散劑。其他一般使用之介面活性劑如Tween、Spans或其他相似之乳化劑或係一般醫藥製造業所使用於醫藥可接受之固態、液態或其他可用於劑型開發之生物可利用增強劑。
    用於口服投藥之組合物則係採用任何一種口服可接受之劑型，其型式包括膠囊、錠劑、片劑、乳化劑、液狀懸浮液、分散劑、溶劑。口服劑型一般所使用之載體，以錠劑為例可為乳糖、玉米澱粉、潤滑劑，如硬脂酸鎂為基本添加物。而膠囊使用之稀釋液包括乳糖與乾燥玉米澱粉。製成液狀懸浮液或乳化劑劑型，係將活性物質懸浮或溶解於結合乳化劑或懸浮劑之油狀介面，視需要添加適度之甜味劑，風味劑或係色素。
    鼻用氣化噴霧劑或吸入劑組成物，可根據已知之製劑技術進行製備。例如，將組成物溶於生理食鹽水中，添加苯甲醇或其他適合之防腐劑，或促吸收劑以增強生物可利用性。本發明化合物之組合物亦可製成栓劑，進行經直腸或陰道之投藥方式。
    本發明化合物亦可運用『靜脈投藥』，其係包括經由皮下、腹腔、靜脈、肌肉，或關節腔內、顱內、關節液內、脊髓內注射，主動脈注射，胸腔注射，疾病部位內注射，或其他適合之投藥技術。
    本案所提出之「改善高脂血及體重失衡之KMUP類四級銨哌嗪鹽類」將可由以下之實施例說明而得到充分瞭解，使得熟習本技藝之人士可以據以完成之，然而本案之實施並非可由下列實施例而被限制其實施型態，熟習本技藝之人士仍可依據除既揭露之實施例之精神推演出其他實施例，該等實施例皆當屬於本發明之範圍。 實驗材料及方法：
    活性實驗：
    5週大雄性C57BL/6J，購自國家動物實驗中心，餵養於高雄醫學大學動物實驗中心。 實驗藥品之配置：
    (1).KMUP類，實驗中所使用之KMUP或其複合銨鹽類為本實驗室所合成之化合物。以去離子水溶解，使其濃度為10-2 M，再依所需濃度以去離子水稀釋。
    (2).　Y27632((R)-(+)-trans-4-(1-Aminoethyl)-N-(4-Pyridyl)cyclohexanecarboxamide dihydrochloride monohydrate)以去離子水溶解，使其濃度為10-2 M，再依所需濃度以去離子水稀釋。
    (3).　辛伐他汀(2,2-dimethylbutanoic acid(1S,3R,7S,8S,8aR)-1,2,3,7,8,8a-hexahydro-3,7-dimethyl-8-[2-[(2R,4R)-tetra-hydro-4-hydroxy-6-oxo-2H-pyran-2-yl]ethyl-1-maphthalenyl ester,Simvastatin)以甲基亞碸(DMSO)溶解，使其濃度為10-2 M，再依所需濃度以去離子水稀釋。 實驗藥品： B.　西德Merck公司：
    甲醇、氯化鈉、氫氧化鈉 C.　美國Sigma-Aldrich公司：
    牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin,BSA)
    甘油(Glycerol)
    硫酸乙醯肝素(Heparin Sulfate)
    三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris(hydroxymethyl)amino-methane HCl,Tris-HCl)
    Tween-20
    磷酸鹽緩衝液(Phosphate-Buffered Saline,PBS)緩衝液(10倍) D,美國Bio-Rad公司：
    過硫酸銨(Ammonium Persulfate,APS)
    30%丙烯醯胺/雙丙烯醯胺(Acrylamide/Bis-acrylamide,Acrylamide/Bis)(37.5:1)試劑
    2-巰基乙醇(2-Mercapethanol)四甲基乙二胺(N,N,N’,N’-Tetramethyl-Ethylene Diamine,TEMED)
    蛋白質分析染料(Protein Assay Dye)
    十二烷基硫酸鈉(Sodium Dodecyl Sulfate,SDS)
    三羥甲基氨基甲烷(Tris Base)
    甘胺酸(Glycine) E.　美國Roche公司：
    混合片劑(Complete Mini Cocktail表t)
    蛋白酶抑制混合片劑(Complete,Mini Protease Inhibitor Cocktail表ts) F.　美國Millipore公司：
    聚偏氟乙烯(Polyvinylidene Difluoride,PVDF)膜
    增強型化學冷光檢測技術(Enhanced Chemiluminescence,ECL) G.　日本OSAKA公司：
    羧甲基纖維素鈉(Sodium carboxymethyl cellulose,sodium CMC) H.　抗體(Antibody)：
    (1)　一級抗體(Primary antibody)
    內皮性一氧化氮合成酶抗體(Anti-eNOS: Upstate Lab oratories,U.S.A.)
    Rho關聯蛋白激酶抗體(Anti-ROCR: Upstate,U.S.A.)
    RhoA抗體(Anti-RhoA: Santa Cruze,U.S.A.)
    5-羥色胺2B受體之抗體(Anti-5-HT2B: Upstate,U.S.A.)
    絲氨酸/蘇氨酸激酶抗體(Anti-AKT: Santa Cruz Biotechnology,U.S.A.)
    絲氨酸/蘇氨酸激酶磷酸化抗體(Anti-phosphor-AKT: Santa Cruz Biotechnology,U.S.A.)
    5-羥色胺轉運體抗體(Anti-5-HTT: Chemicon Biotechnology,U.S.A.)
    胞外信號調節激酶抗體(Anti-ERK1/2: Santa Cruz Biotechnology,U.S.A.)
    胞外信號調節激酶磷酸化抗體(Anti-phosphor-ERK1/2: Santa Cruz Biotechnology,U.S.A.)
    肌動蛋白抗體(Anti-β-actin: Sigma-Aldrich,U.S.A.)
    (2)　二級抗體(Second antibody)：
    辣根過氧化物酶標記山羊抗小鼠抗體(Goat anti-mouse IgG Horseradish Peroxidase Conjugate: Santa Cruz Biotechnology,U.S.A)
    辣根過氧化物酶標記山羊抗兔抗體(Goat anti-rabbit IgG Horseradish Peroxidase Conjugate: Santa Cruz Biotechnology,U.S.A)
    辣根過氧化物酶標記山羊抗山羊抗體(Goat anti-goat IgG Horseradish Peroxidase Conjugate: Santa Cruz Biotechnology,U.S.A) I.實驗緩衝溶液之製備：
    (1) 1.5 M三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl) pH 8.8：取27.23 g三羥甲基氨基甲烷(Tris base)溶於80 mL去離子水中，以1N氯化鈉調整pH值至8.8，最後加去離子水使最終體積為150 mL，儲存於4℃。
    (2) 0.5 M Tris-HCl,pH 6.8：取6.0 g Tris base溶於60 mL去離子水，以1N鹽酸調整pH值至6.8，最後加去離子水使最終體積為100 mL，儲存於4℃。
    (3) 10%十二烷基硫酸鈉(SDS)：取10 g SDS混勻於90 mL去離子水，最後加去離子水使最終體積為100 mL，儲存於室溫。
    (4)　組織或細胞裂解液(Tissue or Cell lysis buffer)：取10 ml培養細胞總蛋白提取試劑(Mammalian Protein Extraction Reagent,T-PERTM)預冷，隨後添加一錠蛋白酶抑制劑混合物(Complete mini protease inhibitor cocktail)混合均勻。置於-80℃貯存。
    (5)　細胞培養液(cell culture)：將10%胎牛血清(Fetal Bovine Serum,FBS)、20 ml麩醯胺酸(glutamine)、20 ml抗生素、3 g碳酸氫鈉(NaHCO3)與最低必需培養基(Minimum Essential Medium，MEM)粉末混合添加去離子水至2公升，調整pH值至7.2。
    (6)細胞冷凍保存液(cell Cryopreservation medium)：10%胎牛血清(FBS)、7%二甲基亞碸(Dimethyl sulfoxide,DMSO)和1 x最低必需培養基(MEM medium)
    (7)胰酶細胞消化液：0.25%胰蛋白酶(Trypsin)與0.02%乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetates,EDTA)混合
    (8)　平衡緩衝液(Hank's balanced salt solution,HBSS)：氯化鈉(NaCl) 8克、氯化鉀(KCl) 0.4克、硫酸鎂(MgSO4‧7H2O) 0.1克、氯化鎂(MgCl‧6H2O) 0.1克、無水氯化鈣(CaCl2) 0.14克、葡萄糖1.0毫克、磷酸氫二鈉(NaHPO4) 0.154克、磷酸二氫鉀(KH2PO4) 0.06克，混合後添加0.4%酚红液5毫升、去離子水至1公升，有的不加酚红。
    十二烷基硫酸鈉聚丙烯醯胺凝膠電泳(Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis,SDS-PAGE)之溶液配製
    (1)5X　分離膠體緩衝液(Running buffer)：
    三羥甲基氨基甲烷(Tris Base)　15 g
    甘胺酸(Glycine)　72 g
    十二烷基硫酸鈉(SDS)　5 g
    去離子水　加至1 L
    *使用前，以去離子水稀釋成1倍running buffer。
    (2)　轉漬緩衝液(Transfer buffer)：
    Tris Base　12.1 g
    Glycine　57.652 g
    甲醇　800 mL
    去離子水　3200 ml
    (3)　洗滌緩衝液(Washing buffer,t-TBS)：
    Tris Base　9.68 g
    氯化鈉　32 g
    Tween-20　4 mL
    去離子水　加至1 L
    6 N之HCl調整酸鹼度pH=7.6。
    (4) 5X檢品溶液(Sampleb　uffer)：
    去離子水H2O　3.8 mL
    0.5M　Tris-HCl,pH 6.8　1.0 mL
    甘油(Glycerol)　0.8 mL
    10% SDS　1.6 mL
    2-Mercaptoethanol　0.4 mL
    1%溴酚藍(Bromophenol Blue)　0.4 mL
    泡製成5倍濃縮液，儲存於室溫。
    (5)　阻隔緩衝液(Blocking buffer)：
    洗滌緩衝液　100 ml
    脫脂奶粉　5.0 g
    SDS-PAGE膠片之配製(Laemmli buffer system)
    (1)7.5%分離膠體(Separating gel)溶液之製備：


    均勻混合總體積為10mL
    (2) 8.5%分離膠體(Separating gel)溶液之製備：

    均勻混合總體積為10mL
    (3) 12%分離膠體(Separating gel)溶液之製備：

    均勻混合總體積為10mL
    (4) 14%分離膠體(Separating gel)溶液之製備：

    均勻混合總體積為10mL
    混合均勻後，倒入MINI-PTOTEAM II裝置內，並以去離子水壓膠，靜置約40～50分鐘待其成型。依所需探討之蛋白質分子量，選擇膠片：蛋白質分子量低者，適用高濃度膠片，反之亦然。
    (5) 4%積層膠(Stacking gel)溶液之製備：

    均勻混合總體積為5mL
    傾出分離膠體上層之水層，加入均勻混合之上膠溶液，隨即擺上樣本齒模(Comb)，於室溫靜置待凝。若液面下降，須隨時補充膠體溶液。 實驗儀器：
    (1)　酸鹼測定儀(pH meter/SP-701):SUNTEX,Taiwan
    (2)　酵素免疫分析儀(Enzyme-Linked Immunosorbant Assay reader/MRX)：DYNEX Technologies,Germany
    (3)　迷你蛋白電泳槽(Mini- 3 Cell):Bio-Rad Laboratories Inc.,U.S.A.
    (4)　迷你蛋白轉印槽(Mini Trans- Electrophoretic Transfer Cell) Bio-Rad Laboratories Inc.,U.S.A.
    (5)　電源供應器(Power supply/POWER PAC HC):Bio-Rad Laboratories Inc.,U.S.A.
    (6)　冷凍離心機：Kubota 8800,Japan
    (7)　微量離心機：Eppendorf 5415 C,Taiwan
    (8)　自動沖片機及暗房工程：M43 716-7957,Kodak,U.S.A
    (9)　螢光光度計(spectroflurophotometer: Shimadzu,RF-5301PC,Japan)
    (10)　電腦介面顯微鏡(computer-interfaced light microscope(Eclipse TE2000-S microscope,Nikon,Tokyo,Japan) 實驗方法
    一、KMUP-1及Simvastatin影響血脂異常小鼠之血清生化值實驗
    A.　血脂異常之動物模式：
    將5週大之雄性C57BL/6J小鼠36隻隨機分成6組，分別如下。每隻老鼠每3天記錄1次飼料攝取量和體重。
    a.　餵食標準飼料(standard diet,STD)組8週
    b.　餵食高脂肪飼料(high-fat diet,HFD)組8週以引起血脂異常：其組成為60 cal%脂肪(fat),21.3 cal%碳水化合物(carbohydrates)以及18.7 cal%蛋白質(protein)
    c.　投與高脂肪飼料8週同時經口投與(p.o.)1 mg/kg KMUP-1
    d.　投與高脂肪飼料8週同時經口投與2.5 mg/kg KMUP-1
    e.　投與高脂肪飼料8週同時經口投與5 mg/kg KMUP-1
    f.　投與高脂肪飼料8週同時經口投與5 mg/kg Simvastatin
    B.　摘取老鼠組織和心臟血液：
    a.　各組C57BL/6J小鼠飼養8週後，經氨基鉀酸酯(urethane)麻醉後，以食指或中指趾腹輕壓小鼠胸部感受其心跳確定其位置後，將1 c.c.針筒26 G之針頭插入心臟，抽取心臟血液(過程應避免溶血)，立即以3000 rpm離心15分鐘將血清與血漿分離，在-80℃下保存其血清，以便分別進行血清總膽固醇(TC)、三酸甘油酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白(HDL)和天門冬氨酸氨基轉移酶(aspartate aminotransferase,AST)、丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase,ALT)生化值之測定。上述生化值檢測使用Hitachi Clinical Analyzer 7070(HitachiHigh-Technologies Co. Tokyo,Japan)與commercial kit(Sigma-Aldrich,St Louis,MO,USA).均委託尚捷醫事檢驗所負責測定。
    將抽取心臟血後，立即取出老鼠之左葉肝臟，收藏至-80℃冰箱(待進行西方墨點法之實驗)。
    二、西方點墨法(Western Blotting)探討KMUP-1及Simvastatin影響血脂異常小鼠肝臟組織之Rho kinase、PPARγ、HMGR、ABCA1蛋白表現：
    1.　組織處理：
    取出上述冷藏於-80℃冰箱之左葉肝臟，浸泡在組織裂解液(Tissue lysis buffer)中，置於冰上以小剪剪碎，再以超音波均質機於冰上將組織均質化，並離心(15000 rpm，30 min，4℃)後，取上清液。
    2.　蛋白質含量測定：
    以蛋白質測定濃縮劑(Bio-Rad染劑)測定蛋白質含量。Bio-Rad染劑係含有考馬斯亮藍(Coomassie Brilliant Blue G-250)之酸溶液，當該染劑和蛋白質結合形成複合體(Complex)，其光譜之最大吸收波長由456 nm轉移至595 nm；依此特性可直接經由酵素免疫分析儀(ELISA reader)分別測定標準液之標準曲線，對照由波長595 nm下檢品之測定吸光值，即可知檢品溶液所含之蛋白質量。
    標準液配置-以濃度0.1mg/ml胎牛血清(Bovine serum albumin，BSA)做為蛋白質含量標準，並配置成各種已知蛋白質含量之標準液(蛋白質含量為0、2、4、8、12、16、20和30 μg/ml)。
    蛋白質萃取液之濃度測定方式-取237 μl去離子水加上3μl細胞萃取液，分別添加60μl之蛋白質測定濃縮劑呈色後。以酵素免疫分析儀測定波長595 nm下之吸光值，並對照標準曲線以推算蛋白質萃取液之濃度。
    3.　蛋白質電泳分離：
    定量分裝、稀釋蛋白質萃取液後，加入四分之一量之檢品溶液(sample buffer)，並於沸騰之水中加熱5分鐘。然後依序將檢品添加至10%硫酸十二酯鈉-聚合丙醯胺凝膠(SDS-PAGE)上之各槽(well)，並同時以未染色蛋白質分子量標準品(prestained protein molecular weight standards)比對分子量位置。添加分離膠體緩衝液(running buffer)於電泳槽內，以固定80伏特之電壓進行30分鐘電泳，隨後以180伏特電壓繼續進行電泳至SDS-PAGE之染劑跑出SDS-PAGE後，則中止電源。
    4.　免疫墨點法(Immunoblotting)：
    完成電泳解析後，小心取下膠片置於轉漬緩衝液(Transfer buffer)內平衡。另外裁下與膠片相同尺寸之3 mm濾紙(filter paper)，將其浸潤在轉漬緩衝液中平衡。將事先裁好與膠片同樣尺寸之聚偏氟乙烯(Polyvinylidene Difluoride,PVDF)膜，依序以甲醇活化30秒、去離子水浸洗2分鐘，最後浸潤在轉漬緩衝液中平衡15分鐘以上。待膠片、濾紙、聚偏氟乙烯膜完成平衡後，在飽和吸濕之石墨負極板上，依序先墊上兩張濾紙，鋪上膠片，覆蓋一張PVDF膜，滴少許轉漬緩衝液至PVDF膜，蓋上兩張濾紙，並注意勿留下氣泡，最後蓋上飽和吸濕之石墨正極板，形成“三明治(sandwich)”夾層狀。利用濕式轉漬系統(Wet blotter system)進行轉漬過程，將三明治夾層置於轉漬緩衝液，以固定電流轉漬1.5小時。其中固定電流之數值依照膠片面積×0.8毫安培(mA/cm2)計算值設定。膠片之蛋白質完全轉漬至PVDF膜後，取下PVDF膜浸潤於適量之阻隔緩衝液(Blocking buffer)，放置於水平迴轉搖盪器上，於室溫下緩慢震搖2小時。隨後以洗滌緩衝液(T-TBS)連續洗滌6次每次5分鐘，接著於4℃下將稀釋完成之初級抗體(primary antibody solution)均勻覆蓋在PVDF膜上過夜，進行作用。隔日以洗滌緩衝液持續滌6次每次5分鐘後，將帶有辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標記之二級抗體(Secondary antibody solution)稀釋至合適濃度，均勻傾倒於PVDF膜上震盪反應1小時。反應完成後再以洗滌緩衝液持續滌7次每次5分鐘。最後加入檢測緩衝液(Detection buffer,ECL)作用2分鐘，待略乾後以底片壓片、洗片即完成。將結果以密度計及分析軟體進行分析及定量。
    三、羥甲基戊二醯輔酶A還原酶(HMGR)活性分析實驗
    1.　原理：
    羥甲基戊二醯輔酶A還原酶(HMG-CoA reductase,HMGR)之反應式：HMG-CoA+2NADPH+2H+→mevalonate+2NADP++CoA-SH利用酵素免疫分析儀測定波長340nm，減少吸收波長340nm之量就是煙醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)之反應量，NADPH之反應量越多代表HMGR活性越高，投與具有抑制HMGR活性作用之藥物，減少NADPH所參與反應之量則越低，藉此可比較藥物間抑制HMGR活性作用之高低。
    2.　步驟：
    a.　先將酵素免疫分析儀設定在37℃和波長340 nm，依據表五在96槽反應盤添加適當之反應試劑。
    b.　每個槽孔都添加適當試劑後，立即放入酵素免疫分析儀讀取吸光值，第一次讀取時必須震搖10秒鐘，然後每30秒讀取一次，達30分鐘為止。
    c.　讀取之數值帶入動力學公式：
    TV=反應盤之反應總容量(Total volume of the reaction in ml,0.2 ml for plates)
    V=參與分析之酵素容量(volume of enzyme used in the assay,ml)
    LP=比色杯管徑(Light path in cm,0.55 for plates)Units/mg-protein=(ΔA340/minsample-ΔA340/minblank)*TV/12.44*V*0.6*LP　單位為：μmol/min/mg-protein。
    (註)1.　緩衝液(buffer)係1×Assay buffer
    2.　藥物係選用Simvastatin或KMUP-1
    四、細胞培養
    1. HepG2細胞初代培養：
    首先將細胞迅速移至37℃水浴箱內使其在1分鐘內迅速解凍，隨即將細胞冷凍保存液(cell Cryopreservation medium)吸至無菌離心管以1,000 rpm離心5分鐘，移除上清液，添加細胞培養液(cell culture)將離心管底部細胞打散並移至10公分培養皿，靜置於37℃恆溫及飽和水蒸氣(5%二氧化碳，95%空氣)之培養箱內，讓細胞貼附。
    2. HepG2繼代培養：
    將培養數日之培養液吸除後，以新鮮培養液沖下細胞，即可用椎藍(trypan blue)染色計數細胞並分盤培養。
    3.　冷凍細胞保存：
    10公分培養皿長滿單層細胞，以1 ml胰酶細胞消化液作用後，輕拍使細胞脫落，添加10 ml培養液並將細胞打散，置於15 ml離心管中離心1,000 rpm 5分鐘，傾去上清液，添加細胞冷凍保存液1 ml並打散細胞，分裝於冷凍保存管中(1 ml/vial)，逐漸降低溫度，依序為-20℃，30分鐘；-80℃，24小時；最後儲存於-196℃液態氮槽。
    五、比較各組細胞中ROCK Ⅱ以及RhoA、ABCA1、PPAR-γ、LXR-α、APOA-1蛋白質之表現及差異
    1. HepG2細胞前處理：
    將藥物依序加入細胞進行作用後，將細胞刮下並加入磷酸鹽緩衝液(PBS)回溶。以1,500 rpm、4℃離心5分鐘。抽掉上清液，加入適當量之細胞裂解液(Cell Lysis Buffer)劇烈振搖後以13,000 rpm、4℃離心15分鐘。取出上清液進行試驗。
    2.　細胞質蛋白質之萃取：
    依各組條件進行反應後取出培養皿，以冷藏之平衡緩衝液(HBSS)洗滌2次，再將多餘之HBSS甩乾置於冰上。添加細胞裂解液和碘化丙啶(propidium iodide,PI)作用15分鐘後將細胞刮下，最後在4℃下13,000 rpm離心30分鐘並取出上清液，此上清液為細胞質層之蛋白質淬取液。
    3.　細胞膜蛋白質之萃取：
    依各組條件進行反應後取出培養皿，以冷藏之平衡緩衝液(HBSS)洗滌2次，再將多餘之HBSS甩乾置於冰上。添加細胞裂解液和碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)作用15分鐘後將細胞刮下，最後在4℃下13,000 rpm離心30分鐘並取出上清液，此上清液為細胞質層之蛋白質淬取液。
    加入1%Triton和PI，以超音波震盪均質化後，在4℃下15000 rpm離心60分鐘。上清液即為細胞膜蛋白質萃取液。後續進行蛋白質含量之測定，以西方點墨法比較各組細胞蛋白質之表現及差異。
    六、統計分析(Statistical analysis)
    所有實驗數據結果表示，皆由平均值加減標準誤(Mean±s.e.m.)及百分率(%)表示。統計之間之差異，在非配對及配對樣本中分別採用非相依性之Student’s t-test或相依性之t-test。此外，只有一組對照組比較多組實驗組時，則採用repeated-measure ANOVA。當利用ANOVA統計有差異時，則使用Dunnett’s test作為事後檢定。當p值小於0.05時，表示具有統計學上顯著性差異。 實施例一　製備KMUP-1鹽酸鹽(7-[2-[4-(2-chlorobenzene)piperazinyl]ethyl]-1,3-dimethyl xanthine HCl)
    取KMUP-1(8.3 g)溶於混合著乙醇(10 mL)與1 N鹽酸(60 mL)之溶液，於50℃下反應20分鐘，室溫下添加乙醇(20 mL)放置過夜進行結晶，過濾獲得KMUP-1鹽酸鹽(6.4 g)。 實施例二　製備KMUP-3鹽酸鹽(7-[2-[4-(4-nitrobenzene)piperazinyl]ethyl]-1,3-dimethyl xanthine HCl)
    取KMUP-1(8.3 g)溶於混合著乙醇(10 mL)與1 N鹽酸(60 mL)之溶液，於50℃下反應20分鐘，室溫下添加乙醇(20 mL)放置過夜進行結晶，過濾獲得KMUP-3鹽酸鹽(6.6 g)。 實施例三　製備KMUP-2-聚丙烯酸複合物
    取KMUP-2(8 g)溶於混合著乙醇(10 mL)與聚丙烯酸(2.5 g)之溶液，於50℃下反應10分鐘，室溫下添加乙醇(20 mL)放置過夜進行結晶，過濾獲得KMUP-2-聚丙烯酸複合物(7.4 g)。 實施例四　製備KMUP-3-聚海藻酸複合物
    取12.5 g聚海藻酸鈉(APA)溶於40 ml氫氧化鈉(5%)之水溶液，加入8.3 g之KMUP-3 HCl置於50℃下反應10分鐘，室溫下添加乙醇(20 mL)放置過夜進行結晶，過濾獲得KMUP-3-聚海藻酸複合物(31.4 g)。 實施例五　製備KMUP-1-聚麩胺酸複合物
    取KMUP-1(7.9 g)溶於混合著乙醇(10 mL)與3.8 g聚麩胺酸之溶液，於50℃下反應10分鐘，室溫下添加乙醇(20 mL)放置過夜進行結晶，過濾獲得KMUP-1-聚麩胺酸複合物(10.4 g)。 實施例六　製備KMUP-1-羧甲基纖維素複合物
    取20 g之羧甲基纖維素鈉(sodium CMC)溶於40 ml氫氧化鈉(5%)之水溶液，加入16 g之KMUP-1 HCl置於50℃下反應10分鐘，室溫下添加乙醇(20 mL)放置過夜進行結晶，過濾獲得KMUP-1-羧甲基纖維素複合物(31.4 g)。 實施例七　製備KMUP-2-玻尿酸複合物
    取KMUP-2(8 g)溶於混合著乙醇(10 mL)與玻尿酸(2.5 g)之溶液，於50℃下反應10分鐘，室溫下添加乙醇(20 mL)放置過夜進行結晶，過濾獲得KMUP-2-玻尿酸複合物(9.4 g)。 實施例八　製備KMUP-4-硫酸乙醯肝素複合物
    取KMUP-4(8.3 g)溶於混合著乙醇(10 mL)與硫酸乙醯肝素(8.5 g)之溶液，於50℃下反應10分鐘，室溫下添加乙醇(20 mL)放置過夜進行結晶，過濾獲得KMUP-4-硫酸乙醯肝素複合物(9.2 g)。 實施例九　製備KMUP-1-硫酸葡聚醣複合物
    取KMUP-1(8 g)溶於混合著乙醇(10 mL)與硫酸葡聚醣(3.5 g)之溶液，於50℃下反應10分鐘，室溫下添加乙醇(20 mL)放置過夜進行結晶，過濾獲得KMUP-1-硫酸葡聚醣複合物(10.6 g)。 實施例十　製備KMUP-4-聚麩胺酸複合物
    取KMUP-4(8.3 g)溶於混合著乙醇(10 mL)與聚麩胺酸(3.8 g)之溶液，於50℃下反應10分鐘，室溫下添加乙醇(20 mL)放置過夜進行結晶，過濾獲得KMUP-4-聚麩胺酸複合物(9.2 g)。 實施例十一　製備KMUP-1-聚麩胺酸複合物
    取KMUP-1(8.3 g)溶於混合著乙醇(10 mL)與聚麩胺酸(3.8 g)之溶液，於50℃下反應10分鐘，室溫下添加乙醇(20 mL)放置過夜進行結晶，過濾獲得KMUP-1-聚麩胺酸複合物(9.2 g)。 實施例十二　製備KMUP-1-聚乳酸複合物
    取KMUP-1(8.3 g)溶於混合著乙醇(10 mL)與聚乳酸(3.2 g)之溶液，於50℃下反應10分鐘，室溫下添加乙醇(20 mL)放置過夜進行結晶，過濾獲得KMUP-1-聚乳酸複合物(9.4 g)。 實施例十三　製備KMUP-1-聚羥基乙酸複合物
    取KMUP-1(8.3 g)溶於混合著乙醇(10 mL)與聚羥基乙酸(3.5g)之溶液，於50℃下反應10分鐘，室溫下添加乙醇(20 mL)放置過夜進行結晶，過濾獲得KMUP-1-聚羥基乙酸複合物(9.6 g)。 實施例十四　製備錠劑之組合物
    分別依量秤取下列各成分，混和後充填於打錠機，製備成錠劑
    KMUP-1-玻尿酸　140 mg
    乳糖　qs
    玉米粉　qs 實施例十五　製備錠劑之組合物
    分別依量秤取下列各成分，混和後充填於打錠機，製備成錠劑
    KMUP-1-羧甲基纖維素　160 mg
    乳糖　qs
    玉米粉　qs
    其他實施例
    1.一種改善高脂血之複合鹽類化合物，如式(I)所示結構之四級銨，其中
    R2與R4可分別選自以下所組成之群組：氫基、鹵素、胺基、硝基之取代基；碳數1-5烷基之取代基；碳數1-5烷氧基之取代基；RX其係選自以下所組成含羧酸基團群組之一：Statin類藥物、羧甲基纖維素鈉(sodium CMC)、高分子聚合物或聚麩胺酸基團衍生物藥物；以及-RX可為上述基團帶負電之陰離子。
    2.如實施例1之複合鹽類化合物，其中含羧酸基團之聚麩胺酸基團衍生物係選自海藻酸鈉(alginate sodium)、聚麩胺酸(γ-PGA)、聚麩胺酸鈉(γ-PGA sodium)或是聚海藻酸鈉(APA)。
    3.如實施例1項之複合鹽類化合物，其中含羧酸基團之Statin類藥物係選自阿托伐他汀(Atorvastatin)、西立伐他汀(Cerivastatin)、氟伐他汀(Fluvastatin)、羅瓦斯達汀(Lovastatin)、美伐他汀(Mevastatin)、普伐他汀(Pravastatin)、瑞舒伐它汀(Rosuvastatin)、以及辛伐他汀(Simvastatin)。
    4.如實施例1之複合鹽類化合物，其中高分子聚合物係選自玻尿酸(hyaluronic acid)、聚丙烯酸(polyacrylic acid)、聚甲基丙烯酸脂(Polymethacrylates)、優特奇(Eudragit)、硫酸葡聚醣(dextran sulfate)、硫酸乙醯肝素(heparan sulfate)、聚乳酸(Polylactic acid,PLA)、聚羥基乙酸(Polyglycolic acid,PGA)、聚乳酸鈉(Poly(lactic acid sodium),PLA sodium)、聚羥基乙酸鈉(Poly(glycolic acid sodium),PGA sodium)。
    5.一種改善高脂血複合鹽類化合物，其係選自以下之四級銨鹽類：KMUP類與Statin類藥物所合成之四級銨鹽類；KMUP類化合物與羧甲基纖維素鈉(sodium CMC)所合成之四級銨鹽類；KMUP類化合物與高分子聚合物所合成之四級銨鹽類；以及KMUP類與含羧酸基團之聚麩胺酸基團衍生物所合成之四級銨鹽類。
    6.如實施例5之複合鹽類化合物，其中KMUP類化合物係選自7-2-4-(2-氯苯)哌嗪基]乙基]-1,3-二甲基黃嘌呤(7-[2-[4-(2-chlorophenyl)piperazinyl]ethyl]-1,3-dimethyl-xanthine,KMUP-1)；7-2-4-(2-甲氧基苯)哌嗪基]乙基]-1,3-二甲基黃嘌呤(7-[2-[4-(2-methoxybenzene)-piperazinyl] ethyl]-1,3-dimethylxanthine,KMUP-2)；7-2-4-(4-硝基苯)哌嗪基]乙基]-1,3-二甲基黃嘌呤(7-[2-[4-(4-nitrobenzene)piperazinyl]ethyl]-1,3-dimethylxanthine,KMUP-3)；以及7-2-4-(2-硝基苯)哌嗪基]乙基]-1,3-二甲基黃嘌呤(7-[2-[4-(2-nitrobenzene)piperazinyl]ethyl]-1,3-dimethylxanthine,KMUP-4)等KMUP類化合物。
    7.如實施例5之複合鹽類化合物，其中含羧酸基團之聚麩胺酸基團衍生物係選自海藻酸鈉(alginate sodium)、聚麩胺酸(γ-PGA)、聚麩胺酸鈉(γ-PGA sodium)或是聚海藻酸鈉(APA)。
    8.如實施例5之複合鹽類化合物，其中含羧酸基團之Statin類藥物係選自阿托伐他汀(Atorvastatin)、西立伐他汀(Cerivastatin)、氟伐他汀(Fluvastatin)、羅瓦斯達汀(Lovastatin)、美伐他汀(Mevastatin)、普伐他汀(Praxastatin)、瑞舒伐它汀(Rosuvastatin)、以及辛伐他汀(Simvastatin)。
    9..一種改善高脂血醫藥組合物，係包含：藥學上可接受之載體；以及一有效量如式(I)所示四級銨結構之主成分，其中
    R2與R4可分別選自以下所組成之群組：氫基、鹵素、胺基、硝基之取代基；碳數1-5烷基之取代基；碳數1-5烷氧基之取代基；RX其係選自以下所組成含羧酸基團群組之一：Statin類藥物、羧甲基纖維素鈉(sodium CMC)、高分子聚合藥物或聚麩胺酸基團衍生物藥物；以及-RX可為上述基團帶負電之陰離子。
    10.一種改善高脂血醫藥組合物，係包含：藥學上可接受之載體；以及選自以下之四級銨鹽類：KMUP類與Statin類藥物所合成之四級銨鹽類；KMUP類化合物與羧甲基纖維素鈉(sodium CMC)所合成之四級銨鹽類；KMUP類化合物與高分子聚合物所合成之四級銨鹽類；以及KMUP類與含羧酸基團之聚麩胺酸基團衍生物所合成之四級銨鹽類。
    11.一種改善體重失衡之複合鹽類化合物，如式(I)所示結構之四級銨，其中
    R2與R4可分別選自以下所組成之群組：氫基、鹵素、胺基、硝基之取代基；碳數1-5烷基之取代基；碳數1-5烷氧基之取代基；RX其係選自以下所組成含羧酸基團群組之一：Statin類藥物、羧甲基纖維素鈉(sodium CMC)、高分子聚合藥物或聚麩胺酸基團衍生物藥物；以及-RX可為上述基團帶負電之陰離子。
    12.一種改善體重失衡複合鹽類化合物，其係選自以下之四級銨鹽類：KMUP類與Statin類藥物所合成之四級銨鹽類；KMUP類化合物與羧甲基纖維素鈉(sodium CMC)所合成之四級銨鹽類；KMUP類化合物與高分子聚合物所合成之四級銨鹽類；以及KMUP類與含羧酸基團之聚麩胺酸基團衍生物所合成之四級銨鹽類。
    13.一種改善體重失衡醫藥組合物，係包含：藥學上可接受之載體；以及一有效量如式(I)所示四級銨結構之主成分，其中
    R2與R4可分別選自以下所組成之群組：氫基、鹵素、胺基、硝基之取代基；碳數1-5烷基之取代基；碳數1-5烷氧基之取代基；RX其係選自以下所組成含羧酸基團群組之一：羧甲基纖維素鈉(sodium CMC)、高分子聚合藥物或聚麩胺酸基團衍生物藥物；以及-RX可為上述基團帶負電之陰離子。
    14.一種改善體重失衡醫藥組合物，係包含：藥學上可接受之載體；以及選自以下之四級銨鹽類：KMUP類與Statin類藥物所合成之四級銨鹽類；KMUP類化合物與羧甲基纖維素鈉(sodium CMC)所合成之四級銨鹽類；KMUP類化合物與高分子聚合物所合成之四級銨鹽類；以及KMUP類與含羧酸基團之聚麩胺酸基團衍生物所合成之四級銨鹽類。
    15　如上述實施例之複合鹽類化合物，其中KMUP類化合物係選自7-2-4-(2-氯苯)哌嗪基]乙基]-1,3-二甲基黃嘌呤(7-[2-[4-(2-chlorophenyl)piperazinyl]ethyl]-1,3-dimethyl-xanthine,KMUP-1)；7-2-4-(2-甲氧基苯)哌嗪基]乙基]-1,3-二甲基黃嘌呤(7-[2-[4-(2-methoxybenzene)-piperazinyl] ethyl]-1,3-dimethylxanthine,KMUP-2)；7-2-4-(4-硝基苯)哌嗪基]乙基]-1,3-二甲基黃嘌呤(7-[2-[4-(4-nitrobenzene)piperazinyl]ethyl]-1,3-dimethylxanthine,KMUP-3)；以及7-2-4-(2-硝基苯)哌嗪基]乙基]-1,3-二甲基黃嘌呤(7-[2-[4-(2-nitrobenzene)piperazinyl]ethyl]-1,3-dimethylxanthine,KMUP-4)等KMUP類化合物。
    16.如上述實施例之複合鹽類化合物，其中含羧酸基團之聚麩胺酸基團衍生物係選自海藻酸鈉(alginate sodium)、聚麩胺酸(γ-PGA)、聚麩胺酸鈉(γ-PGA sodium)或是聚海藻酸鈉(APA)。
    17.如上述實施例之複合鹽類化合物，其中含羧酸基團之Statin類藥物係選自阿托伐他汀(Atorvastatin)、西立伐他汀(Cerivastatin)、氟伐他汀(Fluvastatin)、羅瓦斯達汀(Lovastatin)、美伐他汀(Mevastatin)、普伐他汀(Pravastatin)、瑞舒伐它汀(Rosuvastatin)、以及辛伐他汀(Simvastatin)。
    18.如上述實施例之醫藥組合物，其中KMUP類化合物係選自7-2-4-(2-氯苯)哌嗪基]乙基]-1,3-二甲基黃嘌呤(7-2-[4-(2-chlorophenyl)piperazinyl]ethyl]-1,3-dimethyl-xanthine,KMUP-1)；7-2-4-(2-甲氧基苯)哌嗪基]乙基]-1,3-二甲基黃嘌呤(7-[2-[4-(2-methoxybenzene)-piperazinyl] ethyl]-1,3-dimethylxanthine,KMUP-2)；7-2-4-(4-硝基苯)哌嗪基]乙基]-1,3-二甲基黃嘌呤(7-[2-[4-(4-nitrobenzene)piperazinyl]ethyl]-1,3-dimethylxanthine,KMUP-3)；以及7-2-4-(2-硝基苯)哌嗪基]乙基]-1,3-二甲基黃嘌呤(7-[2-[4-(2-nitrobenzene)piperazinyl]ethyl]-1,3-dimethylxanthine,KMUP-4)等KMUP類化合物。
    19.如上述實施例之醫藥組合物，其中高分子聚合物係選自玻尿酸(hyaluronic acid)、聚丙烯酸(polyacrylic acid)、聚甲基丙烯酸脂(Polymethacrylates)、優特奇(Eudragit)、硫酸葡聚醣(dextran sulfate)、硫酸乙醯肝素(heparan sulfate)、聚乳酸(polylactic acid或稱為polylactide,PLA)、聚羥基乙酸(polyglycolic acid,PGA)、聚乳酸鈉(polylactic acid sodium,PLA sodium)、聚羥基乙酸鈉(polyglycolic acid sodium,PGA sodium)。
    20.如上述實施例之醫藥組合物，其中含羧酸基團之Statin類藥物係選自阿托伐他汀(Atorvastatin)、西立伐他汀(Cerivastatin)、氟伐他汀(Fluvastatin)、羅瓦斯達汀(Lovastatin)、美伐他汀(Mevastatin)、普伐他汀(Pravastatin)、瑞舒伐它汀(Rosuvastatin)、以及辛伐他汀(Simvastatin)。
    21.如上述實施例之醫藥組合物，其中高分子聚合物係選自玻尿酸(hyaluronic acid)、聚丙烯酸(polyacrylic acid)、聚甲基丙烯酸脂(Polymethacrylates)、優特奇(Eudragit)、硫酸葡聚醣(dextran sulfate)、硫酸乙醯肝素(heparan sulfate)、聚乳酸(polylactic acid或稱為polylactide,PLA)、聚羥基乙酸(polyglycolic acid,PGA)、聚乳酸鈉(polylactic acid sodium,PLA sodium)、聚羥基乙酸鈉(polyglycolic acid sodium,PGA sodium)。 參考文獻
    Bin-Nan Wu,Rong-Jyh Lin,Yi-Ching Lo,Kuo-Pyng Shen,Chao-Chuan Wang,Young-Tso Lin,Ing-Jun Chen British journal of pharmacology. 09/2004;142(7):1105-14.
    Argmann,C. A.,J. Y. Edwards,et al.(2005)."Regulation of macrophage cholesterol efflux through hydroxymethylglutaryl-CoA reductase inhibition: a role for RhoA in ABCA1-mediated cholesterol efflux."J. Biol. Chem. 280(23): 22212-22221.
    Brewer HB(2004) N Engl J Med 350:1491-1494
    James K,Liao and Ulrich,Laufs.(2005). Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 45: 89-118
    Waiczies S,et al.,(2007) The Journal of Immunology. 179,6024-6032.
    第一圖　HMGR蛋白表現量
    投與0.001-10 μM劑量之KMUP-1，以及投與simvastatin(10 μM)觀察羥甲基戊二醯輔酶A還原酶(HMGR)之蛋白表現量，*P<0.05與對照組(CTL)相比。
    第二圖　HePG2細胞株之HMGR蛋白表現量比率
    第二圖(A)分別投與10-9-10-5 M劑量之KMUP-1，*P<0.05與對照組相比，**P<0.01與對照組相比。
    第二圖(B)分別投與10-9-10-5 M劑量之投與simvastatin，*P<0.05與對照組相比，**P<0.01與對照組相比。
    第三圖　高脂肪飼料餵食之HMGR蛋白表現量比率
    高脂肪飼料(HFD)餵食之老鼠，依照體重投與1、2.5、5 mg/kg劑量之KMUP-1或5 mg/kg劑量之simvastatin，## P<0.01與標準飼料(STD)相比，*P<0.05與未投與KMUP-1相比，**P<0.01與未投與KMUP-1相比。
    第四圖　影響HMGR之蛋白表現量比率
    第四圖(A)添加10-100 μM mevalonate觀察HMGR表現量之減少比率，*P<0.05與對照組相比，**P<0.01與對照組相比。
    第四圖(B)添加100 μM mevalonate，再投與10-5 M藥物simvastatin或KMUP-1觀察HMGR之蛋白表現量比率，## P<0.01與空白試劑相比，**P<0.01與未添加mevalonate相比。
    第五圖　高脂肪飼料餵食老鼠之蛋白表現量比率
    第五圖(A)高脂肪飼料餵食之老鼠分別投與1、2.5、5mg/kg劑量KMUP-1或5 mg/kg之simvastatin，影響過氧化物酶體增殖物啟動受體-γ(PPAR-γ)之蛋白表現量比率。
    第五圖(B)分別投與1、2.5、5mg/kg劑量KMUP-1或5 mg/kg之simvastatin，影響腺苷三磷酸結合盒轉運子A1(ABCA1)之表現量比率。
    第五圖(C)分別投與1、2.5、5mg/kg劑量KMUP-1或5 mg/kg之simvastatin，影響Rho關聯蛋白激酶2(ROCKII)之表現量比率，*P<0.05與未投與KMUP-1相比，**P<0.01與未投與KMUP-1相比。
    第六圖　HePG2細胞之PPAR-γ表現量
    第六圖(A)投與10-9-10-5 M劑量KMUP-1影響PPAR-γ之表現量比率。
    第六圖(B)投與10-9-10-5 M劑量simvastatin影響PPAR-γ之表現量比率。## P<0.05、*P<0.05與對照組相比，**P<0.01與對照組相比。
    第七圖　HePG2細胞之腺苷三磷酸結合盒轉運子A1表現量
    第七圖(A)投與10-9-10-5M劑量KMUP-1影響ABCA1之表現量比率。
    第七圖(B)投與10-9-10-5 M劑量simvastatin影響ABCA1之表現量比率。## P<0.05、*P<0.05與對照組相比，**P<0.01與對照組相比。
    第八圖　HePG2細胞之載脂蛋白A－1表現量
    第八圖(A)投與10-9-10-5 M劑量KMUP-1影響APOA-1之表現量比率。
    第八圖(B)投與10-9-10-5 M劑量simvastatin影響APOA-1之表現量比率。## P<0.05、*P<0.05與對照組相比，**P<0.01與對照組相比。
    第九圖KMUP-1影響肝細胞X受体α基因(LXR-α)之表現量
    投與0.001-10 μM劑量KMUP-1影響LXR-α之表現量比率。*P<0.05與對照組相比，**P<0.01與對照組相比。
    第十圖　細胞膜之RhoA活性
    投與10-9-10-5 M劑量KMUP-1影響RhoA之表現量比率，*P<0.05與對照組相比，**P<0.01與對照組相比。
    第十一圖　高脂肪飼料老鼠之ROCKII表現
    分別投與1、2.5、5mg/kg劑量KMUP-1或5mg/kg劑量simvastatin影響Rho關聯蛋白激酶2(ROCKII)之表現量比率，*P<0.05與對照組相比，**P<0.01與對照組相比。
    第十二圖　HepG2細胞之ROCKII表現
    第十二圖(A)投與10-9-10-5 M劑量KMUP-1影響ROCKII之表現量比率。
    第十二圖(B)投與10-9-10-5 M劑量simvastatin影響ROCKII之表現量比率，*P<0.05與對照組相比，**P<0.01與對照組相比。
    第十三圖　影響HepG2細胞蛋白之表現
    第十三圖(A)分別投與KMUP-1(10-5 M)、Simvastatin(10-5 M)、C3 exoenzyme(10 mg/kg)與Y27632(10-5 M)影響ROCK II之表現比率。
    第十三圖(B)分別投與KMUP-1(10-5 M)、Simvastatin(10-5 M)、C3 exoenzyme(10 mg/kg)與Y27632(10-5 M)影響PPAR-γ之表現比率，# P<0.05、*P<0.05與對照組相比，**P<0.01與對照組相比。
    第十三圖(C)分別投與KMUP-1(10-5 M)、Simvastatin(10-5 M)、C3 exoenzyme(10 mg/kg)與Y27632(10-5 M)影響ABCA1之表現比率，# P<0.05、*P<0.05與對照組相比，**P<0.01與對照組相比。
    第十四圖　RhoA/ROCK II蛋白之表現
    第十四圖(A)添加10μM異戊二烯焦磷酸(FPP)處理後再投與10-9-10-5 M劑量KMUP-1影響ROCK II蛋白之表現比率。
    第十四圖(B)添加10μM四異戊二烯焦磷酸(GGPP)處理後再投與10-9-10-5 M劑量KMUP-1影響ROCK II蛋白之表現比率，# P<0.05、*P<0.05與對照組相比，**P<0.01與對照組相比。
    第十四圖(C)添加10μM四異戊二烯焦磷酸處理後再投與10-9-10-5 M劑量KMUP-1影響細胞膜ROCK II蛋白之表現比率，# P<0.05、*P<0.05與對照組相比，## P<0.01、**P<0.01與對照組相比。
    第十五圖　GGPP處理後simvastatin影響蛋白之表現添加10μM四異戊二烯焦磷酸處理後再投與10-9-10-5 M劑量之simvastatin影響PPAR-γ蛋白之表現比率，# P<0.05與對照組相比。
    第十六圖　HepG2細胞經FPP處理後蛋白之表現
    第十六圖(A)添加10μM焦磷酸處理後再投與10-9-10-5 M劑量KMUP-1影響PPAR-γ蛋白之表現比率。
    第十六圖(B)添加10μM焦磷酸處理後再投與10-9-10-5 M劑量KMUP-1影響ABCA1蛋白之表現比率，# P<0.05、*P<0.05與對照組相比，## P<0.01、**P<0.01與對照組相比。
    第十七圖HepG2細胞經GGPP處理後蛋白之表現
    第十七圖(A)添加10μM四異戊二烯焦磷酸(GGPP)處理後再投與10-9-10-5 M劑量KMUP-1影響PPAR-γ蛋白之表現比率。
    第十七圖(B)添加10μM四異戊二烯焦磷酸處理後再投與10-9-10-5 M劑量KMUP-1影響ABCA1蛋白之表現比率，# P<0.05、*P<0.05與對照組相比，**P<0.01與對照組相比。
    第十八圖　Rp-8-pCPT-cGMPs影響ROCK II之表現於HepG2細胞單獨添加10μM之cGMP抑制劑Rp-8-pCPT-cGMPs，或以相同濃度之Rp-8-pCPT-cGMPs與KMUP-1同時添加，影響ROCK II蛋白之表現比率，## P<0.01、**P<0.01與對照組相比。
    权利要求:
    Claims (10)
    [1] 一種改善高脂血複合鹽類化合物，其係選自如式(I)所示結構之KMUP類四級銨複合鹽類四級銨鹽類： 其中R2與R4可分別選自以下所組成之群組：氫基、鹵素(氟、氯、溴、碘)、胺基、硝基之取代基；碳數1-5烷基之取代基；碳數1-5烷氧基之取代基；RX其係選自以下所組成含羧酸基團群組之一：羧甲基纖維素鈉(sodium CMC)、高分子聚合藥物或聚麩胺酸基團衍生物；以及-RX可為上述基團帶負電之陰離子。
    [2] 如申請專利範圍第1項之複合鹽類化合物，其中高分子聚合物係選自玻尿酸(hyaluronic acid)、聚丙烯酸(polyacrylic acid)、聚甲基丙烯酸脂(Polymethacrylates)、優特奇(Eudragit)、硫酸葡聚醣(dextran sulfate)、硫酸乙醯肝素(heparan sulfate)、聚乳酸(polylactic acid或稱為polylactide,PLA)、聚羥基乙酸(polyglycolic acid,PGA)、聚乳酸鈉(polylactic acid sodium,PLA sodium)、聚羥基乙酸鈉(polyglycolic acid sodium,PGA sodium)。
    [3] 如申請專利範圍第1項之複合鹽類化合物，其中含羧酸基團之聚麩胺酸基團衍生物係選自海藻酸鈉(alginate sodium)、聚麩胺酸(γ-PGA)、聚麩胺酸鈉(γ-PGA sodium)或是聚海藻酸鈉(APA)。
    [4] 如申請專利範圍第1項之複合鹽類化合物，其中含羧酸基團之Statin類藥物係選自阿托伐他汀(Atorvastatin)、西立伐他汀(Cerivastatin)、氟伐他汀(Fluvastatin)、羅瓦斯達汀(Lovastatin)、美伐他汀(Mevastatin)、普伐他汀(Pravastatin)、瑞舒伐它汀(Rosuvastatin)、以及辛伐他汀(Simvastatin)。
    [5] 一種改善高脂血醫藥組合物，係包含：藥學上可接受之載體；以及選自以下之四級銨鹽類：KMUP類與Statin類藥物所合成之四級銨鹽類；KMUP類化合物與羧甲基纖維素鈉(sodium CMC)所合成之四級銨鹽類；KMUP類化合物與高分子聚合物所合成之四級銨鹽類；以及KMUP類與含羧酸基團之聚麩胺酸基團衍生物所合成之四級銨鹽類。
    [6] 如申請專利範圍第5項之醫藥組合物，其中含羧酸基團之聚麩胺酸基團衍生物係選自海藻酸鈉(alginate sodium)、聚麩胺酸(γ-PGA)、聚麩胺酸鈉(γ-PGA sodium)或是聚海藻酸鈉(APA)。
    [7] 如申請專利範圍第5項之醫藥組合物，其中含羧酸基團之Statin類藥物係選自阿托伐他汀(Atorvastatin)、西立伐他汀(Cerivastatin)、氟伐他汀(Fluvastatin)、羅瓦斯達汀(Lovastatin)、美伐他汀(Mevastatin)、普伐他汀(Pravastatin)、瑞舒伐它汀(Rosuvastatin)、以及辛伐他汀(Simvastatin)。
    [8] 一種改善體重失衡複合鹽類化合物，其係選自以下之四級銨鹽類：KMUP類與Statin類藥物所合成之四級銨鹽類；KMUP類與羧甲基纖維素鈉(sodium CMC)所合成之四級銨鹽類；KMUP類化合物與高分子聚合物所合成之四級銨鹽類；以及KMUP類與含羧酸基團之聚麩胺酸基團衍生物所合成之四級銨鹽類。
    [9] 一種改善體重失衡醫藥組合物，係包含：藥學上可接受之載體；以及選自以下之四級銨鹽類：KMUP類與Statin類藥物所合成之四級銨鹽類；KMUP類化合物與羧甲基纖維素鈉(sodium CMC)所合成之四級銨鹽類；KMUP類化合物與高分子聚合物所合成之四級銨鹽類；以及KMUP類與含羧酸基團之聚麩胺酸基團衍生物所合成之四級銨鹽類。
    [10] 一種改善高脂血醫藥組合物，係包含：藥學上可接受之載體；以及一有效量如式(I)所示KMUP類四級銨複合鹽類結構之主成分，其中 R2與R4可分別選自以下所組成之群組：氫基、鹵素(氟、氯、溴、碘)、胺基、硝基之取代基；碳數1-5烷基之取代基；碳數1-5烷氧基之取代基；RX其係選自以下所組成含羧酸基團群組之一：羧甲基纖維素鈉(sodium CMC)、高分子聚合藥物或聚麩胺酸基團衍生物；以及-RX可為上述基團帶負電之陰離子。
    类似技术:
    公开号 | 公开日 | 专利标题
    TWI381841B|2013-01-11|An immunosuppressive agent and an antitumor agent containing a heterocyclic compound as an active ingredient
    JP2019089830A|2019-06-13|噴霧乾燥製剤
    Shan et al.2013|Berberine analogue IMB-Y53 improves glucose-lowering efficacy by averting cellular efflux especially P-glycoprotein efflux
    EA020494B1|2014-11-28|3-[4-|-1H-ПИРАЗОЛ-1-ИЛ]ОКТАН- ИЛИ ГЕПТАННИТРИЛ КАК JAK-ИНГИБИТОРЫ
    JP5291700B2|2013-09-18|血管新生阻害薬及び使用方法
    EP2651403B1|2020-12-02|Use of lp-pla2 inhibitors in the treatment and prevention of eye diseases
    WO2015069217A1|2015-05-14|Src kinase inhibition as treatment for lympangioleiomyomatosis and tuberous sclerosis
    TW200529813A|2005-09-16|Cancer therapy
    WO2015025228A2|2015-02-26|Compositions and therapeutic methods for accelerated plaque regression
    US20150306107A1|2015-10-29|SAA Derivative Compound Restores eNOS And Inhibits Oxidative Stress-Induced A Diseases In Hypoxia
    TWI542350B|2016-07-21|Ｋｍｕｐ複合銨鹽類及高分子聚合物之改善高脂血及體重失衡療效
    US20220047582A1|2022-02-17|Phenylpiperazine proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 | modulators and their use
    WO2015031109A1|2015-03-05|Inhibition of wnt, tgf beta and hippo signaling pathways to treat cancer, organ fibrosis and metabolic disorders
    JP2018515563A|2018-06-14|化合物
    TWI702962B|2020-09-01|治療脂質代謝紊亂的組合物及其方法
    CN104884061A|2015-09-02|用于治疗Rac-GTP酶介导的病症的化合物
    CA2605332A1|2006-10-26|Method and composition for inhibiting cell proliferation and angiogenesis
    EP2992885A2|2016-03-09|Method for inhibiting a liver disease
    US20120251482A1|2012-10-04|Use for improving 5-ht function and enos expression of kmups amine salts
    US20200392119A1|2020-12-17|Novel chalcone-based chemotherapeutic compound for triple negative breast cancer
    JPWO2019189241A1|2021-03-18|肝細胞癌治療剤
    Meijering et al.2014|Inhibition of ER stress-induced autophagy preserves proteostasis and protects against cardiomyocyte dysfunction in experimental and human Atrial Fibrillation
    AU2015101666A4|2016-02-18|PDEdelta INHIBITOR FOR THE TREATMENT OF CANCER
    TW201509417A|2015-03-16|健脂靈類化合物增加動物換肉率
    TW201416075A|2014-05-01|健脂靈類化合物增加肥胖動物換肉率，減少飼養率及肥胖組織之效益
    同族专利:
    公开号 | 公开日
    HK1183624A1|2014-01-03|
    TWI542350B|2016-07-21|
    CN102973566A|2013-03-20|
    CN102973566B|2015-10-07|
    US20130202549A1|2013-08-08|
    引用文献:
    公开号 | 申请日 | 公开日 | 申请人 | 专利标题
    US20050209243A1|2002-09-27|2005-09-22|Ing-Jun Chen|Theophylline-based soluble guanylyl cyclase activators KMUP-1 analogues enhanced cyclic GMP and K+ channel activities on rabbit corpus cavernosum smooth muscle and intercavernous pressure activities|
    US8470805B2|2009-04-30|2013-06-25|Kaohsiung Medical University|Processes for preparing piperazinium salts of KMUP and use thereof|
    TWI368513B|2009-04-30|2012-07-21|Univ Kaohsiung Medical|Synthesis of pulmodil and pulmodil-1, two chlorophenylpiperazine salt derivatives, and rhokinase-dependent inhibition activity on pulmonary artery endothelium dysfunction, medial wall thickness and vascular obstruction thereof|CN104274465A|2013-07-10|2015-01-14|陈昭良|Dpa 类似物用于保护生理活性免于功能障碍|
    CN105380949A|2014-09-02|2016-03-09|健脂生物科技股份有限公司|治疗高脂肪食品诱发肝脏脂肪蓄积的组合物|
    CN107334770A|2016-05-02|2017-11-10|健脂生物科技股份有限公司|治疗脂质代谢紊乱的组合物及其方法|
    法律状态:
    优先权:
    申请号 | 申请日 | 专利标题
    TW100132154A|TWI542350B|2011-09-06|2011-09-06|Ｋｍｕｐ複合銨鹽類及高分子聚合物之改善高脂血及體重失衡療效|TW100132154A| TWI542350B|2011-09-06|2011-09-06|Ｋｍｕｐ複合銨鹽類及高分子聚合物之改善高脂血及體重失衡療效|
    CN201210326693.4A| CN102973566B|2011-09-06|2012-09-05|DPAs及高分子聚合物用于高脂血以及降低肥胖动物摄取食物量、脂肪组织重量|
    US13/605,889| US20130202549A1|2011-09-06|2012-09-06|Use of dpas and co-polymers for hyperlipidemia and atherosclerosis along with reducing feeding rate and adipose tissue weight of obesity animal|
    HK13110748.9A| HK1183624A1|2011-09-06|2013-09-18|及高分子聚合物用於高脂血以及降低肥胖動物攝取食物量、脂肪組織重量|
    US14/833,989| US20150359798A1|2011-09-06|2015-08-24|Piperazinyl derivative reduces high-fat diet-induced accumulation of fat in the livers, therapeutically|
    US14/834,961| US20150359901A1|2011-09-06|2015-08-25|Piperazinyl derivative reduces high-fat diet-induced accumulation of fat in the livers, therapeutically|
    [返回顶部]